与微卫星高度不稳定性（MSI-H）结直肠癌相比，微卫星稳定（MSS）结直肠癌的突变数量极少，对免疫检查点抑制剂（ICB）不敏感。接受靶向药物治疗的结直肠癌在疾病进展时常出现大量基因组变异。本研究旨在探讨靶向治疗是否能在MSS结直肠癌中诱导产生高肿瘤突变负荷（TMB），并使这类肿瘤对ICB增敏。针对接受靶向治疗的MSS转移性结直肠癌患者，研究者评估了其基线和疾病进展时的TMB，以及肿瘤发展为高TMB的患者对ICB的应答情况。研究者明确了获得性高TMB病例中，新发基因组变异相关的变异类型、突变特征、新抗原性和克隆性。
26例患者中，9例在疾病进展时出现获得性高TMB，其中3例接受了ICB治疗，但均未产生应答。在高TMB病例中，未发现肿瘤浸润淋巴细胞或PD-L1表达的诱导激活。获得性基因组变异主要为单核苷酸变异，富集单碱基替换17a/b突变特征，且未增强预测的MHC I类分子结合能力。与仅存在少量耐药变异的组织样本相比，血浆中的TMB更高，这是由高度亚克隆的获得性变异所导致。
相当一部分MSS结直肠癌在靶向治疗后会获得高TMB，但这种变化与对ICB的增敏作用无关。高TMB源于各病变部位特有的亚克隆变异，而这些变异不足以引发有效的抗肿瘤免疫应答。
研究背景
展开剩余94%免疫检查点抑制剂（ICB）彻底改变了临床治疗结局，目前已成为晚期错配修复缺陷（MMRd）/微卫星高度不稳定性（MSI-H）结直肠癌患者的标准治疗方案。MMRd/MSI-H肿瘤的特征为错配修复（MMR）基因发生基因学或表观遗传失活，进而导致大量突变产生并富集新抗原，使其对ICB产生应答。相比之下，除DNA聚合酶ε（POLE）突变型结直肠癌外，错配修复功能正常（MMRp）/微卫星稳定（MSS）肿瘤通常表现为染色体不稳定性，但肿瘤突变负荷（TMB）较低，导致肿瘤浸润淋巴细胞水平低下，对ICB的敏感性极低。MMRp/MSS亚型约占转移性结直肠癌（mCRC）病例的95%，因此，为这类免疫“冷”肿瘤开发新的治疗方案具有迫切的临床需求。
针对结直肠癌中常见致癌驱动因子的靶向治疗，包括EGFR，以及近年来的BRAF V600E、KRAS G12C和HER2过表达/扩增靶向治疗，为分子分型筛选后的转移性结直肠癌患者拓展了治疗选择，并延长了其生存期。然而，与其他肿瘤类型相比，结直肠癌靶向治疗的疗效受限于应答持续时间短和获得性耐药的快速出现。对结直肠癌靶向治疗获得性耐药的研究表明，癌细胞可通过诱导增强突变的程序来逃避治疗作用，而对疾病进展时患者样本的分析通常发现，同一患者体内会出现多种耐药变异。因此，研究者提出疑问：靶向治疗带来的选择性压力是否能在结直肠癌中诱导产生高TMB，且这种效应是否可用于激发患者对ICB的应答。
研究方法
研究采用纪念斯隆凯特琳癌症中心可操作癌症靶点整合分析panel（MSK-IMPACT）对肿瘤组织进行分析，该panel是基于杂交捕获的下一代测序（NGS）panel，涵盖340~505个基因。采用微卫星不稳定性检测算法（MSIsensor）判定微卫星状态。组织TMB（tTMB）的计算方式为：体细胞非同义突变的总数（包括癌基因中的驱动突变）除以相应MSK-IMPACT测序panel的外显子覆盖范围（兆碱基，Mb）。
采用GuardantOMNI（Guardant Health, Inc. 公司）检测法对循环游离DNA（cfDNA）进行了分析。该检测panel为靶向下一代测序panel，可检测496个基因中的单核苷酸变异（SNV）和小插入/缺失（indel）、106个基因中的拷贝数变异、21个基因中的融合突变，同时可检测微卫星不稳定性和血浆TMB（pTMB）。对可获得的配对（基线和疾病进展时）肿瘤活检样本进行苏木精-伊红染色，通过免疫组化（IHC）染色评估CD3、CD8和PD-L1（克隆号E1L3N）的表达，并由专业亚专科病理医师进行分析。
研究结果
靶向治疗后高TMB病例的筛选：
研究者首先明确靶向治疗是否能将肿瘤转化为高TMB表型。回顾本中心接受靶向治疗的MMRp/MSS转移性结直肠癌患者，纳入标准为：（1）在本中心接受靶向治疗；（2）因疾病进展停止靶向治疗；（3）在基线（靶向治疗前）和疾病进展时采集了血浆和/或肿瘤组织活检样本，并在2024年7月16日前通过测序panel完成测序，且测序panel足以评估TMB。最终纳入26例此类患者，均接受了基因组匹配的靶向治疗，靶点包括EGFR（n=8）、KRAS G12C（n=11）和BRAF V600E（n=7），治疗方式包括标准治疗（n=11）、超说明书用药（n=2）和临床试验用药（n=13）。研究者评估了患者基线和疾病进展时的TMB（图1A）。血浆TMB（pTMB）在同一时间点采集的样本中通常高于组织TMB（tTMB），这可能是因为血浆能捕获不同肿瘤部位释放的DNA。为解决样本类型的这种不一致性，研究者对获得性高TMB制定了严格的定义：（1）若基线和疾病进展时的样本类型不同（如基线为组织样本、疾病进展时为血浆样本），TMB较基线升高至少5倍；若样本类型相同（如基线和疾病进展时均为血浆样本），TMB较基线升高至少2倍；（2）疾病进展时，tTMB>10mut/Mb或pTMB>20mut/Mb。本研究的26例患者中，9例转移性结直肠癌符合上述靶向治疗后获得高TMB的标准（图1A和B）。
图1
获得性高TMB的分子决定因素：
研究者试图明确靶向治疗后获得性高TMB的潜在预测因素。对基线肿瘤组织的测序结果显示，靶向治疗后获得高TMB和未获得高TMB的肿瘤之间，tTMB、MSI评分或变异类型分布均无显著差异。与获得性高TMB相关的基线突变特征为载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样（APOBEC）特征（SBS2，P=0.012）和紫外线暴露特征（SBS7a/c/d和SBS38，P=0.023）。由于研究样本量较小，且基线单部位活检样本中检测到的突变数量少，这些分析存在局限性（每个样本的中位余弦相似性=0.73，标准差=0.1）。
ICB的临床应答：
9例靶向治疗后肿瘤获得高TMB的患者中，3例后续接受了ICB治疗（21号、25号和26号患者；图2A）。21号患者为RAS/BRAF野生型（WT）转移性直肠癌，累及肝、肺和骨，接受伊立替康联合抗EGFR单克隆抗体帕尼单抗治疗。基线肝转移灶的tTMB为6.9mut/Mb，疾病进展时骨转移灶的tTMB为11.5mut/Mb，而pTMB为40.19mut/Mb。值得注意的是，疾病进展时的血浆样本被判定为MSI-H，这可能与获得性体细胞致病性MLH1突变（E37*；图1B）有关，该突变的变异等位基因频率（VAF）为3%，但疾病进展时的骨转移灶经免疫组化检测仍为MSS和MMRp。该患者随后接受抗PD-1单克隆抗体帕博利珠单抗治疗，但未出现肿瘤应答，ICB治疗1个月后临床和影像学显示疾病显著进展（图2A）。25号患者为KRAS G12C突变型转移性结直肠癌，累及肝、肺和腹膜，接受KRAS G12C抑制剂索托雷塞联合帕尼单抗治疗，疾病进展时的pTMB为145mut/Mb（MSS）。发现其获得高pTMB后，该患者接受瑞戈非尼联合帕博利珠单抗治疗，但1.4个月后临床和影像学显示疾病进展（图2A）。26号患者为RAS/BRAF野生型转移性直肠癌，累及肝和淋巴结，接受5-氟尿嘧啶联合伊立替康（FOLFIRI方案）并帕尼单抗治疗。基线直肠活检样本的tTMB为4.9mut/Mb，pTMB为6.7mut/Mb；疾病进展时肝转移灶的tTMB为11.5mut/Mb。该患者随后入组临床试验，接受抗PD-1单克隆抗体联合双特异性抗体治疗，但1.5个月后疾病出现显著的临床和影像学进展。ICB治疗进展后，患者的pTMB为124mut/Mb（MSS；图2A）。
图2
研究者评估了获得性高TMB是否与免疫浸润相关。对14号、21号和26号患者的肿瘤活检样本分析发现，靶向治疗前后，肿瘤内免疫浸润的定量评估均显示肿瘤浸润淋巴细胞极少或无，且所有样本中均未检测到PD-L1的表达（图2B）。
突变谱和突变特征分析：
为深入探究患者对ICB无应答的原因，研究者评估了靶向治疗后出现的获得性变异及其潜在的免疫原性。由于9例肿瘤获得高TMB的患者均留存了疾病进展时的血浆样本，为保证分析一致性，后续分析聚焦于循环游离DNA中检测到的变异。
首先，研究者明确了靶向治疗后出现的变异类型。9例肿瘤获得高TMB的患者，其疾病进展时样本中共检测到664个获得性变异，其中61%为单核苷酸变异（SNV，59%为错义突变、2%为无义突变、1%为其他类型），5%为插入/缺失突变（indel，均为移码突变），33%为拷贝数变异（26%为扩增、7%为深度缺失；图3A）。TMB从基线到疾病进展的升高主要由单核苷酸变异的增加导致（图3B）。获得性变异中，约21%（范围：17%~39%）发生在RTK/RAS/RAF/MAPK通路相关基因中。
图3
为明确获得性高TMB的潜在突变过程，研究者从9例肿瘤获得高TMB患者的循环游离DNA中提取单碱基替换（SBS）突变特征（癌症体细胞突变目录），按变异状态（基线vs获得性；图3C）和患者样本分别进行汇总分析（图3D）。疾病进展时出现的主要突变特征为SBS17a/b，该特征与活性氧（ROS）导致的DNA损伤相关。
研究者还对比了获得性高TMB和非获得性高TMB患者疾病进展时cfDNA中提取的突变特征（仅分析获得性突变），发现活性氧相关突变特征（SBS17a/b）在获得性高TMB病例中更常见（P=0.011）。
免疫原性分析：
基于疾病进展时错义突变占主导的发现（图3A），研究者提出假设：获得性变异可能无法产生能有效结合MHC-I类分子的新抗原，因此免疫原性较弱。利用netMHCpan 4.1工具，研究者对7例具备HLA I类基因分型资料的获得性高TMB患者，预测了其cfDNA中检测到的突变所产生的所有潜在肽段的MHC-I类分子结合亲和力。以结合百分位排名<2%为阈值，发现9例患者的获得性突变中，47%（中位值41%，范围33%~69%）能产生新的推定肽段结合体。尽管疾病进展时的获得性变异产生的肽段数量远多于基线，但获得性突变和基线突变产生的肽段结合亲和力平均无显著差异（P=0.46；图3E）。
获得性变异的克隆性：
研究者提出假设：获得性高突变负荷未转化为免疫应答，原因在于获得性突变的亚克隆特性及其产生的新抗原的亚克隆性。研究发现，9例患者的获得性变异中，98%为亚克隆（变异等位基因频率与样本中最大变异等位基因频率的比值<0.5），其中98%为超亚克隆（该比值<0.2；图4A）。最后，研究者评估了克隆和亚克隆变异对总pTMB的贡献。结果显示，pTMB从基线到疾病进展的升高具有统计学意义（P=0.0003），且主要由超亚克隆变异导致（P=0.0004），而克隆性pTMB的变化无统计学意义（P=0.2032；图4B）。
图4
耐药机制的异质性：
本研究数据表明，血浆检测显示的高TMB可能是多个病变部位变异的总和，而每个肿瘤部位的实际TMB仍相对较低。在疾病进展时的组织样本中，仅检测到极少（0~1个）推定耐药变异（图1B）。以截断性驱动突变（如KRAS G12C、TP53或APC突变）为参照进行标准化后，这些变异的变异等位基因频率在所有病例中均>50%。研究者对14号患者在耐药时留存的冷冻组织进行了单细胞DNA（scDNA）测序，以深入了解获得性变异的发生率和共现性。该患者为KRAS G12C突变型转移性结直肠癌，累及肝和肺，经标准化疗后疾病进展，随后接受KRAS G12C抑制剂阿达格拉西布联合抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗治疗（图4C）。疾病进展时的血浆样本显示，KRAS G12C突变的变异等位基因频率为45.9%，出现KRAS高水平扩增，检测到78个获得性突变，变异等位基因频率范围为0.01%~55.6%（包括继发性KRAS突变：G12A、G12V、G13D、G12D、G12S、Q61H和Y96S，变异等位基因频率范围0.01%~1.2%；以及NRAS突变G12D，变异等位基因频率0.02%），pTMB为62.2mut/Mb（图1B）。
对疾病进展时肝活检样本的批量DNA测序（MSK-IMPACT）未检测到cfDNA样本中的继发性KRAS/NRAS突变，仅检测到KRAS G12C突变（变异等位基因频率75.5%）和新发的KRAS扩增（4.1倍变化），提示突变等位基因扩增。该样本的tTMB为8.2mut/Mb。研究者对与批量测序组织样本同期采集的两个不同核心活检样本进行了单细胞DNA测序，结果显示，第一个核心样本中，KRAS G12C突变与其他截断性突变（PIK3CA E545K和TP53 K305fs）存在于同一细胞中，但等位基因频率远更低（图4D）。单细胞拷贝数分析发现，这些细胞中KRAS扩增子的拷贝数较高（图4E），提示野生型KRAS等位基因扩增可能导致KRAS G12C表达量相对降低。第二个核心样本中，KRAS G12C仍为克隆性突变，但存在等位基因失衡（中位变异等位基因频率61.7%，中位拷贝数1.46），提示KRAS G12C表达量相对升高（图4D和E）。
讨 论
本研究对一部分经靶向治疗后TMB显著升高（通常仅在血浆中可检测到）的MSS结直肠癌进行了探究，结果发现，尽管这类患者的pTMB极高，但其肿瘤并未对ICB产生增敏作用。通过对突变特征、免疫原性和克隆性的分析，研究者揭示了这类肿瘤对免疫治疗无应答的机制。
9例获得性高TMB病例中，每例患者的cfDNA中检测到多达132个（中位值35个，范围6~132个）获得性突变，且以单核苷酸变异为主——这类变异的免疫原性低于移码插入/缺失突变，同时几乎所有突变均为亚克隆/超亚克隆。对于疾病进展时同时留存组织和血浆样本的病例，在对应的单部位活检样本中，均未检测到cfDNA中发现的获得性单核苷酸变异或插入/缺失突变，提示血浆检测能捕获多个病变部位的获得性变异。单细胞水平的分析发现，KRAS G12C抑制剂的一种潜在耐药机制存在空间异质性：一个克隆出现野生型KRAS等位基因扩增，进而导致KRAS G12C表达量降低；另一个独立克隆则出现KRAS G12C表达量升高。综上，这些发现提示肿瘤内存在显著的异质性，并支持以下模型：靶向治疗的获得性耐药会产生多个耐药肿瘤“岛”（亚克隆），每个亚克隆在治疗后的TMB仍较低，而这些亚克隆的变异叠加后，检测到的总pTMB会显著升高。本研究数据中，2例患者在ICB治疗进展后进行了血浆测序，结果显示高TMB持续存在，进一步提示免疫系统无法识别和/或清除导致获得性高总TMB的亚克隆。与本研究的模型一致，McGranahan等此前的研究表明，高克隆性新抗原负荷和低新抗原肿瘤内异质性是引发T细胞免疫反应和对ICB产生有效应答的必要条件。这可能是因为肿瘤异质性会降低新抗原的表达量，进而导致T细胞受体识别、启动和激活受损。
尽管结直肠癌靶向治疗耐药的突变谱已得到充分阐明，但这些新发突变产生的潜在机制仍不明确。Russo等此前在结直肠癌细胞系中的研究表明，暴露于EGFR±BRAF靶向药物后，DNA错配修复和同源重组相关基因的转录表达下调，同时伴随DNA损伤诱导、活性氧生成增加，以及DNA损伤修复方式向易错聚合酶修复转变。他们的研究结果支持以下模型：靶向治疗带来的治疗压力会诱导细胞应激，进而触发适应性突变作为应激反应。本研究的获得性高TMB病例中，疾病进展时出现的主要突变特征为SBS17a/b，该特征与活性氧导致的DNA损伤相关，且与EGFR和BRAF靶向治疗的获得性耐药有关。此外，本研究中有1例患者的cfDNA在疾病进展时从MSS转化为MSI-H，同时检测到获得性体细胞致病性MLH1突变。尽管受样本量限制，但本研究数据为适应性突变是结直肠癌靶向治疗耐药的潜在突变过程这一观点，增添了真实世界的临床证据。
据研究者所知，本研究的单细胞DNA分析首次证实，KRAS G12C表达缺失和野生型等位基因扩增是结直肠癌中KRAS G12C抑制剂的潜在耐药机制。通过cfDNA测序、同一病变部位多个核心样本的同步单细胞DNA测序，以及同一转移灶另一核心样本的批量测序，研究者发现该患者的肿瘤中，部分细胞还存在KRAS G12C等位基因扩增。这些数据表明，靶向治疗压力下，高度染色体不稳定性可能是肿瘤内异质性产生的原因之一。
本研究团队此前的研究发现，接受靶向治疗的结直肠癌患者中，获得性变异的数量越多，治疗持续时间越短。近期在乳腺癌和肺癌中的研究表明，APOBEC介导的突变是靶向治疗耐药的驱动因素，但该酶在结直肠癌中的作用尚不清楚。本研究数据提示，APOBEC作为一种基线突变特征，或可预测获得性高TMB的发生，进而预测结直肠癌靶向治疗获得性耐药的快速出现。这一特征或可成为未来的治疗靶点，用于延缓或逆转此类患者的耐药。
由于ICB在MSS结直肠癌中的疗效有限，目前研究人员正致力于将这类“冷”肿瘤转化为免疫“热”肿瘤。多项临床试验设计了通过使用诱变性化疗药物刻意提高TMB的治疗策略。ARETHUSA试验是一项正在进行的Ⅱ期临床试验，该试验采用替莫唑胺对MSS转移性结直肠癌患者进行预处理——替莫唑胺是一种烷化剂，已知可诱导胶质母细胞瘤中MMR基因失活。对于替莫唑胺预处理后肿瘤发展为高TMB（≥20mut/Mb）的患者，后续给予帕博利珠单抗治疗。与本研究中靶向治疗的结果相似，Crisafulli等发现，替莫唑胺预处理后产生的高TMB主要由单核苷酸变异组成，且TMB的升高以亚克隆为主，克隆性TMB仍较低。此外，即使在同一转移灶内，预处理后不同肿瘤部位的tTMB也存在差异。与本研究结果一致，ARETHUSA试验的初步数据显示，患者均未出现客观应答。
本研究存在若干局限性。第一，本研究为小样本回顾性研究，仅3例肿瘤获得高TMB的患者最终接受了ICB治疗。第二，研究队列具有异质性，许多患者在接受靶向治疗的同时还接受了化疗。第三，不同时间点计算TMB所用的检测方法不同，大多数患者基线时采集组织样本，疾病进展时采集血浆样本。最后，其他因素如转移部位和宿主免疫应答，也可能影响肿瘤对ICB的敏感性。本研究中所有肿瘤获得高TMB的患者均存在肝转移，而肝脏转移灶可能会导致肿瘤对ICB产生耐药；同时，这些患者均接受过多线化疗，但结直肠癌化疗并不会影响患者对感染产生有效免疫应答的能力，且已有研究表明化疗可激发宿主的抗肿瘤免疫应答。
总体而言，本研究数据不支持对靶向治疗后获得高TMB的结直肠癌患者使用ICB的治疗策略。研究表明，pTMB并不能反映所有病变部位肿瘤内TMB的真实升高，而是多个病变部位出现的高度亚克隆获得性变异的总和，而每个病变部位的TMB仍较低，不足以引发有效的抗肿瘤免疫应答。若要通过诱变过程或诱变药物将免疫“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，必须使所有病变部位的TMB均一致升高。本研究的真实世界临床证据表明，靶向治疗后，尽管总pTMB较高，但单个肿瘤亚克隆的TMB仍较低，因此无法引发有效的抗肿瘤免疫应答。
参考文献：
Yeh, Celine et al. “Acquired high tumor mutational burden and activity of immunotherapy after targeted therapy in microsatellite stable colorectal cancer.” Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research, 10.1158/1078-0432.CCR-25-2566. 30 Oct. 2025, doi:10.1158/1078-0432.CCR-25-2566
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